常见问题答疑 - 云顶娱乐旧版本

常见问题答疑

常见问题答疑

样本相关
Q:流式细胞仪分选的细胞,研究表达谱,做芯片要求最低量多少?分选的细胞 由于其相似性极大,因此,做生物学重复是否有意义?
A:芯片要求最低量跟细胞来源的关系不大,只要质和量达到芯片最低标准即可。 做生物学重复是否有意义并不是一概而论,需要考虑客户实验的意义。如果单纯去看流式分选出细胞之间的差异,可以不做生物学重复。
 
Q:样本少且量少是否可以做测序或上芯片?
A:这个问题太过笼统,样本少是有多少样本?量少是每个样本有多少量?我们 的芯片或测序都对样本的质和量有明确的规定,请参考我们的取样手册。
 
Q:做 miRNA 芯片,血液必须要 1-2ml 以上才能抽提吗?
A:芯片所需样本量请参考我们的取样手册,并不是说必须要 1ml,而是指 1ml 的样本量抽提出的 RNA 合格概率较高,在低于 1ml 样本量的情况下,抽提失败 的几率会提高,RNA 的质量容易达不到一般的芯片要求,如果客户希望用这样 的样本做,那么所有风险要由客户方承担。
 
Q:最少需要做多少组芯片,也就是最小样本量是多少,必须是一个肿瘤组织对 应一个正常组织吗?能否多个肿瘤组织对一个正常标本?
A:通常情况下最少需要做两组芯片(实验组/对照组),每组一般至少三个样本理论上一个样本也可以进行实验。肿瘤与正常组织成对效果比较好,如果样本获得有困难或经济条件有困难,正常组少一些也可以,如果正常组较少,正常组的 数据就可能无法代表正常组这个群体,会造成检测结果的误差;临床来源的样本 推荐每组 5 个或 5 个以上。
 
芯片相关
Q:基因芯片可以定量吗?
A:可以,基因芯片是一种定性半定量的检测工具。
 
Q:基因芯片与定量 PCR、PCR 芯片之间有什么不同?
A:原理不同:PCR 芯片即利用 PCR 原理的芯片。可以简单理解为检测范围: 基因芯片>PCR 芯片>单个定量 PCR;准确性:单个定量 PCR>PCR 芯片>基因 芯片。
扩增方式不同: 定量 PCR 是将标记有荧光素的 Taqman 探针与模板 DNA 混合后,在引物、dNTP 和聚合酶存在下,完成 95℃预变性 10 秒,95℃5秒, 60℃30 秒,72℃30 秒,40 环热循环,遵守聚合酶链反应规律。 基因芯片中 的 RNA 的"扩增"就是所谓的反转录即以 RNA 为模板,在通用引物、dNTP 和反 转录酶存在下,合成一条与 RNA 模板互补的 DNA 单链为 cDNA,它与 RNA 模板形成 RNADNA 杂交体。随后又在反转录酶的作用下,水解掉 RNA 链,再
以 cDNA 为模板合成双链 cDNA。反应的一般条件 65℃反应 10min、冰浴 5min、 25℃10min、37℃60min、70℃10min。

Q:芯片的标准化数据/差异数据如何查看?
A:所有数据表格的结果内都有文件说明,请参考文件说明对应查看。
 
Q:我们做的实验中,有野生型和基因敲除型小鼠,小鼠有年龄的需要,如果做 芯片,敲除型小鼠有年龄梯度的设定,野生型是否也要设置不同的年龄
A:为什么在敲除小鼠上设定年龄梯度?如果年龄对性状有影响或者需要研究不 同年龄组的小鼠,那么在野生型上也要设置同样的分组;如果年龄对性状影响不 大或者不需要研究不同年龄组的小鼠,那么在做敲除组的时候就没有必要设置年 龄梯度,通常的实验都会选取年龄相似的成年鼠。
Q:做一个新基因的功能研究,新基因的序列是已知的,是用芯片还是测序能做
A:如果做已知序列新基因的功能研究,可以选择直接在细胞系中过表达或抑制该基因的表达来直接看对细胞功能的影响。如果是想用芯片或测序检测新基因以 及新基因能够影响的其他基因表达,请提供该基因的标准名称或数据库编号,如 果芯片有设计该基因探针,可用芯片;如果没有可以选择测序。

Q:问:芯片的探针覆盖率为 4,是指 4 个探针捕获一个基因?4 个探针是一样 的吗?探针覆盖率越大是不是需要的样本量越多?
A:覆盖率对于每个基因不尽相同,一般理解为平均检测一个基因使用多少个探 针或探针组,如果是 4,代表 4 个探针或探针组检测 1 个基因(不是捕获),一般来说 4 个探针都是不一样的。覆盖率一般用在测序中。

Q:CGH 芯片与 Cyto 芯片区别
A:CGH 芯片分辨率较低,最高的分辨率只能到 10KB,Cyto 系列芯片分辨率 较高,平均为 3-5KB;CGH 芯片无法检测 SNP,Cyto 系列芯片可以检测 SNP。 Cyto 系列芯片的准确度较高,CGH 有双标,在一张芯片能同时检测对照组和实 验组。

Q:客户在甲基化芯片做不了的情况下如何推荐 mRNA 芯片
A:看情况,客户只想研究甲基化的情况下不可能推荐其他产品,如果客户可以 接受非甲基化研究,在告诉客户甲基化不可行之后,可以直接询问客户是否考虑 做其他层面的研究,如 mRNA

Q:公司的质控标准
A:我们公司依据 Affymetrix 提供的质控标准做的质控,质控标准如下所示: 杂交混合夜中加入内参试剂,即杂交质控中,每个样本中的四个内参基因的信号 值如 BioB<BioC<BioD<Cre,样本的芯片是合格的;原始信号值大于背景信号 值;检出率是在 dabg 算法下,哪些探针是显著表达的,P 表显著,A 表不显著; 阳性控制与阴性控制对照是用来检测样本中探针表达与不表达的情况,阳性为表达,阴性为不表达,且阳性探针与阴性探针比值大于 0.8,表示芯片检测正常。

Q:不做芯片,所有的数据都是来自数据库,这样做分析后再验证是否有意义
A:该问题一分为二来看:通常的研究项目,自己做实验检测数据比较好,实验 设计、验证、功能实验等都可以根据自己的需要进行调整,如果用别人的数据也 是有意义的,但是会碰到如下问题:别人已经发现的结论无法使用,必须在旧的
数据上找到新的结论,分析的难度增加;别人的样本无法获得,验证难度增加。 如果是与大样本量或人群相关的临床研究,用多方数据进行分析是很有意义的。 可以通过不同人群,不同地方的数据来得出更有意义的结论。

Q:affymetrix 探针设计和 aglient 探针设计的比较
A:1,affymetrix 探针长度是 25bp,aglient 探针长度是 60bp。2,单个探针相比,探针长了特异性强,灵敏度低,探针短了灵敏度高,特异性差,Affymetrix芯片通过加大每个基因的探针覆盖度,相当于十几个探针连起来检测,连起来的 长度比 60 个 bp 还长,弥补了它的特异性查的弱点,从而精确性高。3,aglient 探针长,在洗脱过程中,容易洗脱掉。
Q:关于miRNA芯片检测的数据,发现某一个miRNA信号值在一个样本中显示是P,而在另一个样本中显示A,针对这样的miRNA,后续分析是否可用?
A:数据解析的时,会对检测值做一个判断,如果P值小于0.01就认为是检出标上P。相反,A认为没有检测出,即P/A数量大于或者等于50%,此miRNA方可使用。

测序相关
Q:测序后的分析是否能做,能做到什么程度?
A:我们目前的测序分析只能做 RNA-Seq、外显子捕获测序和全基因组重测序, 物种仅限于有标准基因组的生物,分析程度见分析结果范例。

Q:X10 可以测什么样本?
A:X10 专门用于测人全基因组的重测序。
      X10 不可以用于测:人以外物种的任何文库。

Q:X10 的测序数据质量是多少?
A:Illumina 对 X10 的测序数据质量承诺是:“%Q30 >= 75%”。

Q:什么是半导体测序,有什么优势?
A:半导体测序是一种新型的测序技术,原理简单来说就是使用半导体传感器芯片,对 DNA 复制期间产生的氢离子进行实时的测定。芯片上密布了数百万个微 孔,每个微孔都是单独的反应器,包括一个待测序的 DNA 模板片段。加入一种 dNTP 后,如果加入的这一种 dNTP 和模板中的引导核苷酸互补,就会形成互补 链。在这一过程中释放出一个氢离子,引起 PH 值的改变,从而激发芯片感受器,表明发生了一个反应。因此能够将遗传信息(DNA)直接翻译成数码信息(DNA 序列)。其优势主要在于高效而成本低廉。

Q:做家系连锁分析若做测序,是做两个病人好还是一个病人一个正常
A:连锁分析:是单基因遗传病定位克隆方法的核心。它是利用遗传标记在家系中 进行分型(Genotyping),再利用数学手段计算遗传标记在家系中是否与疾病产 生共分离。连锁分析是利用连锁的原理研究致病基因与参考位点(遗传标记)的关 系。根据孟德尔分离率,如果同一染色体上的位点不连锁,那么遗传标记标将独立于致病基因而分离,与致病基因位于同一单倍体或不同单倍体的机会各占一半, 否则表明连锁的存在
如果一个家系要做连锁分析,首先应该判断该疾病是否为遗传病。在排除家 族性疾病后,再确定它的遗传方式。必须确定了遗传方式才能做连锁分析,所以 与做两个病人好还是一个病人一个正常没有关系,检测的数量越多越好。

Q:ion torrent 与 illumina 二代测序的优劣比较
A:ion torrent 测序主要用于小基因组物种,如细菌和病毒,其优势简单、快速、 成本低。而 illumina 测序应用更广泛,多用于拥有较大基因组的物种。

Q:X10 文库的插入片段是多大?
A:插入片段是以 350Bp 为主峰的 Covaris 打断片段。

Q:X10 的测序数据产量是多少?
A:X10 每个样本至少要测 90G PF data。Illumina 公司保证每个文库在正常上 机条件下,可以产出 90G PF data,如果少于 90G PF data,Illumina 包赔。也就是说:X10 可以测大于等于 90G/文库的数据量,不可以测少于 90G 的数据 量。

Q:我有 200 个样本要测,但是测序价格还是太贵了
A:二代测序的特点是全面扫描,快速发现可能的目标基因,但是成本还是较高。 所以您可以选择 20 个样本做一下测序,发现了潜在几个目标基因之后,再进行 针对性的定量 PCR、siRNA 干扰等实验进后期验证。这样成本不会太高,又可 能很快锁定目标基因。 

Q:你们跟华大比,有什么优势?
A:华大是一家测序规模很大的公司,测序是研究的一种手段,相对于研究手段, 我们更加关注为客户提供优质、快捷的服务,作为研究的一部分,我们不仅仅提供测序,我们还会为您规划测序前的样本组合设计,服务于测序后的信息分析, 针对您的方向,找到测序结果中您的关键结果。

Q:什么是 Q30?
A:Q30是指一个碱基的识别可靠性等于99.9%,或者说出错可能性是0.1%。 Q20则是指碱基识别的可靠性等于99%。 Q30数据量是指一批数据中,质量高 于等于Q30的数据的量的总和。

Q:X10 交付的是什么数据?什么文件格式?
A:X10 交付的是PF 数据。注意:不是Clean data。 文件格式是FASTQ 文件。

Q:测序数据的PF data/PF reads是什么意思?
A:PF是pass filter的意思。也就是质量合格的意思。Illumina的测仪序会自动地对一个read(序列)的质量可靠性进行打分。对于前25个碱基中的是否有两个碱 基的识别可靠性低于0.6,是PF的判断标准。这句话翻译成较容易理解的话: 就
是前25个碱基中,如果低质量的数据有2个或更多,则这条read被判定为不合格, PF就不通过。反之,则质检通过。

Q:石蜡样本是否可以用Highseq X-Ten检测
A:可以用X-Ten检测,相对来说CNV和SV检测不准确,但已有文献发表。建议
用外显子测序。

Q:X10 对样本的数量、质量如何要求?
A:要求每样本2 微克以上抽提好的人全基因组DNA ,浓度大于50ng/uL, OD260/280 在1.8~2.0 之间。

Q:关于做人的先天性缺陷的全基因组测序的测序深度和数据量各是多少?
A:建议测序深度为50X,数据量为90G。

Q:X10的测序数据产量是多少?
A:X10每个样本至少要测90G PF data。Illumina公司保证每个文库在正常上机 条件下,可以产出90G PF data,如果少于90G PF data,也就是说:X10可以测大于等于90G/文库的数据量,不可以测少于90G的数据量。